文章題目：Deep MALDI-MS spatial omics guided by quantum cascadelaser mid-infrared imaging microscopy

發(fā)表期刊：NatureCommunications

研究單位：德國曼海姆應(yīng)用科技大學(xué)儀器分析與生物分析研究所

研究技術(shù)：激光面陣列紅外成像、MALDI質(zhì)譜成像

樣本類型：小鼠腎臟、小鼠大腦、小鼠脊髓等

 2025年5月22日，由德國曼海姆應(yīng)用科技大學(xué)儀器分析與生物分析研究所的Carsten Hopf教授帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》上發(fā)表了題為Deep MALDI-MS spatial omics guided by quantum cascade laser mid-infrared imaging microscopy的論文。在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)采用了布魯克的激光面陣列紅外成像光譜儀HYPERION II ILIM對小鼠腎臟、大腦和脊髓等組織進(jìn)行了超快速成像，該成像技術(shù)可以非標(biāo)記、無損地快速完成整塊切片組織的成像，同時(shí)還能達(dá)到低于1 µm的亞細(xì)胞級空間分辨率，這一技術(shù)可以快速鎖定切片組織的ROI區(qū)域，節(jié)省95%以上的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集時(shí)間。這項(xiàng)技術(shù)與質(zhì)譜成像技術(shù)的集合，很好的克服了質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)采集速度慢的局限。在同樣的時(shí)間內(nèi)，可以進(jìn)行更多樣品的深度質(zhì)譜空間組學(xué)研究，為病理醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究注入了新的活力。

 1. 激光紅外成像快速鎖定目標(biāo)測試區(qū)域，告別質(zhì)譜成像“全組織盲掃"

在空間組學(xué)研究中，高置信度的分子鑒定對于復(fù)雜生物學(xué)機(jī)制探索和空間生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要。然而，當(dāng)前基于質(zhì)譜成像的空間組學(xué)技術(shù)必須在數(shù)據(jù)采集速度與生化分析深度之間做出妥協(xié)。本研究引入快速、免標(biāo)記的激光面陣列紅外成像技術(shù)，引導(dǎo)質(zhì)譜成像精準(zhǔn)定位至微小目標(biāo)區(qū)域，很好的解決了這一矛盾。

從下圖可以看出，激光面陣列紅外成像技術(shù)完成整片鼠腦組織切片的成像僅需10分鐘，并且空間分辨率高達(dá)5微米，通過對紅外光譜進(jìn)行二階導(dǎo)運(yùn)算，找出1466cm?1（CH?彎曲振動(dòng)）和1742cm?1（C=O振動(dòng)）這兩個(gè)特征峰來區(qū)分小腦纖維束（FT）和顆粒層（GL），從而將質(zhì)譜成像的目標(biāo)測試區(qū)域鎖定在一更小區(qū)域，成功避免了“全組織盲掃"。以10微米的空間分辨率對確定的目標(biāo)測試區(qū)域進(jìn)行質(zhì)譜成像，用時(shí)7小時(shí)，相比于整片全掃，節(jié)省了大量測試時(shí)間。

圖1.激光面陣列紅外成像通過空間上的引導(dǎo)鎖定質(zhì)譜成像的數(shù)據(jù)采集區(qū)域

(（i）基于量子級聯(lián)激光器的紅外成像顯微鏡概述，以及激光紅外成像引導(dǎo)質(zhì)譜成像的具體流程。（ii）通過對光譜吸光度值進(jìn)行二階導(dǎo)運(yùn)算，找出1466cm?1（CH?彎曲振動(dòng)）和1742cm?1（C=O振動(dòng)）這兩個(gè)特征峰來區(qū)分小腦纖維束（FT）和顆粒層（GL）。（iii）基于所選特征峰得到的分布圖像和目標(biāo)測試區(qū)域定義。（iv）基于單波數(shù)（1656cm-1）得到的參考圖像。（v）基于所有高光譜數(shù)據(jù)集得到的圖像與基于1656cm-1單波數(shù)得到的參考圖像疊加顯示。（vi）通過iprm-PASEF對鎖定的小腦目標(biāo)測試區(qū)域進(jìn)行質(zhì)譜成像。)

 2. 激光紅外成像快速精準(zhǔn)鎖定微小測試區(qū)域，與耗時(shí)的免疫組化結(jié)果吻合

在體外3D類癌細(xì)胞模型的有氧糖酵解中，QCL-MIR 展現(xiàn)了強(qiáng)大的區(qū)分能力：在由成纖維細(xì)胞 (CCD-1137Sk) 和陽性全角蛋白克隆癌細(xì)胞 (HT-29) 組成的雙培養(yǎng)球體中，激光面陣列紅外成像技術(shù)通過1466 cm?1(CH?彎曲振動(dòng)) 和1742 cm?1 (C=O 振動(dòng)) 這兩個(gè)脂質(zhì)相關(guān)的紅外特征峰的分析，精準(zhǔn)區(qū)分出成纖維細(xì)胞核心與癌細(xì)胞外層，與 MALDI 免疫組化結(jié)果吻合。后續(xù)的質(zhì)譜成像分析發(fā)現(xiàn)：癌細(xì)胞中甘油磷脂 (PI 34:1) 含量更高，而成纖維細(xì)胞中溶解甘油磷脂(LPI 18:0) 含量更高，揭示了腫瘤微環(huán)境中脂質(zhì)代謝的差異化重塑。

圖2.CCD?1137Sk 成纖維細(xì)胞/HT-29 癌細(xì)胞共培養(yǎng) (BCF) 體系與單細(xì)胞成纖維細(xì)胞培養(yǎng) (MCF) 球體的多模態(tài)比較。

（(i)使用波形蛋白抗體 (m/z 1230.84; 成纖維細(xì)胞) 和全角蛋白抗體 (m/z 1288.71; 癌癥) 抗體的多通道MALDI免疫組化質(zhì)譜成像圖 。質(zhì)量窗口±10ppm。（ii）球體切片的紅外成像圖 (脂質(zhì)特征峰1742 cm?1; 二階導(dǎo)），MALDI免疫組化聚類分析 (k = 2) 得出成纖維細(xì)胞核心輪廓 (青色，虛線)。（iii）m/z 835.54 (PI 34:1 [M-H]-; 成纖維細(xì)胞) 和m/z 599.32 (lyso-PI 18:0 1 [M-H]-; 癌癥) 質(zhì)譜成像圖。比例尺, 200 μm）

3.對腎小球進(jìn)行測試，進(jìn)一步驗(yàn)證激光紅外成像鎖定目標(biāo)測試區(qū)域的準(zhǔn)確性

利用酰胺I帶和羰基振動(dòng)之間1720 cm?1處的脂質(zhì)紅外特征峰 (一階導(dǎo)數(shù)) 的差異可以區(qū)分腎小球結(jié)構(gòu)和周圍的腎皮質(zhì)。從而可以將質(zhì)譜成像的數(shù)據(jù)采集時(shí)間減少95% (從整片腎臟組織的216,411個(gè)像素點(diǎn)降低至8483個(gè)像素點(diǎn))。隨后可以將時(shí)間和精力重新聚焦到通過使用iprm-PASEF對鎖定的腎小球中的10種神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行非常高置信度的鑒定。

圖3. (i) 通過ARSA?/?小鼠腎臟（1720 cm?1; 1階導(dǎo)數(shù)）的激光紅外成像圖鎖定的腎小球圖像 (綠色輪廓線) 。（ii）激光紅外成像圖通過高亮的腎小球引導(dǎo)離子圖像

m/z 1151.71 (GM3 34:1;O2[M-H]-；質(zhì)量窗口±10 ppm) 。比例尺, 300 μm。

 4.激光紅外成像鎖定單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞，以及在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用實(shí)例

最后我們測試了激光紅外成像鎖定單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞的可行性。嘗試了用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病研究的冷凍小鼠脊髓切片的灰質(zhì)，通過激光紅外成像成功鑒定了單個(gè)含有神經(jīng)元的細(xì)胞。不同的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元位置由磷脂酰肌醇PI 38:4的空間分布特征表征，并由H&E顯微照片驗(yàn)證。

圖4. (i) 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦瘤小鼠脊髓（1722 cm?1; 一階導(dǎo)數(shù)）與鎖定的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的激光紅外圖像(藍(lán)線)（ii）激光紅外成像引導(dǎo)離子圖像m/z 885.549 (PI 38:4[M-H]-；質(zhì)量窗口±10 ppm)，突出顯示神經(jīng)元細(xì)胞。比例尺，200 μm。

 為了驗(yàn)證激光紅外成像在引導(dǎo)帶有iprm-PASEF技術(shù)的TIMS質(zhì)譜成進(jìn)而推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)方向的潛力，我們研究了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）（一種人類多發(fā)性硬化癥模型）引起的小鼠脊髓白質(zhì)在疾病高峰時(shí)的動(dòng)態(tài)脂質(zhì)重塑。通過對1466 cm?1處的脂質(zhì)特征紅外特征峰進(jìn)行二階求導(dǎo)分析，快速鎖定了小鼠脊髓的白質(zhì)病變區(qū)域，與 H&E 染色的病理結(jié)果高度一致，將測量時(shí)間縮短了20倍。

圖5.激光紅外成像引導(dǎo) TIMS-MSI 分析實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的小鼠脊髓白質(zhì)中的脂質(zhì)重塑。a、b (i) 健康對照組的(Ctrl, a)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 (EAE, b) 1466 cm?1的小鼠脊髓激光紅外圖像(二階導(dǎo)數(shù))，脊髓白質(zhì)中的包含(α -無病變)和(β1)，(β2 -變)。比例尺，300 μm。a, b (ii)激光紅外成像引導(dǎo)PI 38:4 [M-H]-的質(zhì)譜成像。相比之下，對照組脊髓(a)的白質(zhì)比實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(b)的白質(zhì)區(qū)域更小。d 激光紅外成像引導(dǎo)離子成像I m/z 616.472 (CerP 34:1;O2[M-H]-)  II m/z 687.545 (CerPE 36:1; O2 [M-H]-),和m / z 885.549 (PI 38:4 [M-H]-), 如(a, b)中含有(α),(β1)和(β2)。激光紅外圖像和H&E顯微照片供參考。比例尺, 75 μm。

激光紅外顯微鏡LUMOS II ILIM